微生物檢測在理論研究和生物醫學領域都具有重要意義

　　在合適的外界條件下，一個微生物細胞不斷地吸收營養，按照自己的代謝模式進行代謝。如果同化的速度超過異化的速度，原生質的總量(重量、體積、大小)就會不斷增加，于是就有了個體的成長。如果這是一種平衡生長，即當每個細胞成分以適當的比例生長時，達到一定程度后就會繁殖，從而引起個體數量的增加。這時，原來的個體已經發展成了群體。隨著一個群體中每個個體的進一步成長，引起這個群體的成長，可以用它的體積、重量、密度或濃度來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科學研究上是困難的，通常沒有實際意義。微生物以數量取勝， 所以微生物的增長通常是指種群的擴大。微生物的生長繁殖是其與各種內外環境因素相互作用的綜合反映。因此，生長和繁殖可以作為研究各種生理、生化和遺傳問題的重要指標。同時，微生物在生產實踐中的各種應用或病原性、霉變性微生物的防治都與其生長抑制密切相關。因此有必要介紹微生物生長的檢測方法。由于生長意味著原生質含量的增加，所以測定方法都是以直接或間接為基礎，而繁殖的測定則應以計數為基礎。微生物的生長可以通過其重量、體積、密度、濃度來衡量，作為衡量的指標。

　　1.微生物測定法

　　1.1體積測量方法

　　又稱菌絲體濃度測量法，通過測量體積培養基中所含菌絲體的量來反映微生物的生長狀況。方法是:將一定量的培養液(如10 mL)放入帶刻度的離心管中，設定離心時間(如5 min)和轉速(如5000 rpm)，離心后倒出上清液。當測得上清液體積為V時，菌絲體濃度為(10-v)/10。菌絲體濃度的測定是大規模工業發酵生產中微生物生長的重要監控指標。這種方法廣泛、簡單、快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差會很大，因為離心沉淀中混有一些固體營養物，結果會有偏差。

　　干重法

　　它可以通過離心或過濾來確定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將待測體積的培養液倒入離心管中，以設定的離心時間和轉速離心，用清水離心洗滌1-5次，并干燥。干燥可在105℃或100℃的烘箱中進行，或通過紅外線，或通過80℃或40℃的真空干燥，然后稱重。如果用過濾法，絲狀真菌可以用濾紙過濾，細菌可以用醋酸纖維素膜等濾膜過濾。過濾后，用少量水洗滌，并在40℃真空干燥。叫干繁殖法很復雜。通常，當獲得的微生物產物為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母、ADY)、一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

　　1.3濁度法

　　微生物的生長導致培養物濁度增加。紫外分光光度計用于測量該波長處的光吸收值，以判斷微生物的生長情況。一個帶側臂的新三角瓶可以用來定期跟蹤培養物中細菌的生長。將側臂插入光電比色計比色座的孔中，無需取菌液即可隨時測定其生長情況。這種方法主要用于監控發酵工業中細菌的生長。如UN公司的紫外-可見分光光度計，通過用比色管在600 nm波長下測量吸光度值OD600，來監測大腸桿菌的生長和誘導時間。

　　1.4菌絲體長度測量方法

　　對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基中測量菌絲的生長長度，或者用一端開口、帶有刻度的細玻璃管，進入合適的培養基，躺下，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄菌絲的生長長度，從而測量絲狀微生物的生長情況。

　　2.微生物計數法

　　2.1血細胞計數平板法

　　血細胞計數板是一種具有結構尺度和厚度的厚玻璃片。載玻片上有四個凹槽和兩個脊，中央有一個短的水平凹槽和兩個平臺。兩個脊的表面比兩個平臺的表面高0.1毫米。每個平臺上刻有不同規格的網格，中心0.1 mm2的面積上刻有400個小方塊。用油鏡觀察，統計一個大細胞中的微生物數量，就可以算出1毫升菌液中所含的細菌數量。這種方法簡單、直觀、快速，但只適用于對單細胞微生物或絲狀微生物產生的孢子進行計數，結果是包括死細胞在內的細菌總數。

　　2.2染色計數法

　　為了彌補某些微生物在油鏡下不易觀察計數，血細胞計數平板法無法直接區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。借助不同的染料，在顯微鏡下可以更方便地計數活菌。例如，可以用亞甲藍染色液來計數酵母活細胞的數量。染色后，活細胞無色，死細胞藍色。

　　2.3比例計數法

　　將顆粒濃度已知的液體(如霉菌孢子或紅細胞)與待測細胞濃度的菌液按比例均勻混合，通過在顯微鏡視野內計數它們各自的數量，即可得到未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較廣泛。并且有必要制備具有已知顆粒濃度的懸浮液作為標準。

　　2.4液體稀釋法

　　未知細菌樣本被連續稀釋10倍。根據估計的數量，從三個合適的連續10倍稀釋物中取出5 mL樣品，并接種到1 mL至三組15個含有培養液的試管中。培養后，記錄每個稀釋度下生長的試管數，然后通過查MPN(最可能數)得到細菌樣本中的細菌數，根據樣本的稀釋倍數計算活菌含量。這種方法常用于檢測食品中的微生物，如飲用水和牛奶的微生物限度檢查。

　　2.5平板菌落計數法

　　這是一種計數活細菌的常用方法。對待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積稀釋后的菌液，在固化前與合適的固體培養基混合均勻，或將菌液涂布在固化后的固體培養基平板上。孵育后，原始細菌溶液的細菌計數可以通過將平板上出現的菌落數乘以細菌溶液的稀釋度來計算。直徑9 cm的平板上一般要出現50~500個菌落。但是方法比較麻煩，操作者需要熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得到菌液中的活菌數，而且可以一次分離培養菌液中的細菌，得到單克隆。

　　2.6試劑紙

　　在平板計數法的基礎上，開發了用于快速計數的小型商用產品。有小而厚的濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂上吸取合適的培養基，加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)浸泡試驗菌液，然后在密封包裝袋中培養。短期培養后，可將濾紙上玫瑰色微菌落的密度與標準紙色板上的光譜進行比較，以估計樣品的細菌含量。試紙計數法快速準確，避免了平板計數法的人為操作誤差。

　　2.7薄膜過濾法

　　含菌樣品用專用濾膜過濾體積，橙黃染色，紫外顯微鏡下觀察細胞熒光?；罴毎麜l出橙色熒光，而死細胞會發出綠色熒光。

　　3.間接測定法

　　微生物的生長伴隨著一系列生理指標的變化，如pH值、含氮量、含糖量、產氣量等。與生長量平行的生理指標有很多，可以作為生長測量的相對值。因此，生理指標等間接參數可以用來衡量生物量。

　　3.1氮含量的測定

　　大多數細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。根據含氮量×6.25，可以確定粗蛋白的含量。測定氮含量的方法有很多，如碘消化法、磷酸消化法和杜馬斯法測定N2氣體。杜馬斯測量N2氣體的方法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱，產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸收CO2后測量N2的量。

　　3.2碳含量的測定

　　將少量(0.2~2.0 mg干重)生物材料混入1 mL水或無機緩沖液中，用2 mL 2% 2% K2Cr2O7溶液在100℃加熱30分鐘，然后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm波長處讀取吸光度值，計算生長量。需要使用試劑作為空白對照，使用標準樣品作為標準曲線。

　　還原糖測定方法

　　還原糖通常指單糖或寡糖，可被微生物直接利用。還原糖的測定可以間接反映微生物的生長情況，常用于大規模工業發酵生產中微生物生長的常規監測。方法是:離心，取上清液，加入費林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許酸化，在接近終點時加入淀粉溶液，繼續加入Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖含量。

　　3.4氨基氮的測定

　　離心，取上清液，加入甲基紅和指示劑，加入0.02 mol/L NaOH顯色至顏色剛好褪色，加入18%中性底物，反應數分鐘，加入0.02 mol/L NaOH使其變色，根據NaOH用量計算氨基氮含量。根據培養基中氨基氮的含量，可以間接反映微生物的生長狀況。

　　3.5其他生理物質的測定

　　P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指標，如產酸、產氣、產CO2(使用標記作為底物)、耗氧量、粘度和產熱，可用于確定生長。還可以根據反應前后底物濃度、最終產氣量、微生物活性的變化來反映微生物的生長情況。比如在BMP-2的發酵生產中，可以隨時監測溶解氧和pH值的變化來判斷細菌的生長情況。

　　4.商業快速微生物檢測方法

　　微生物檢測的發展方向是快速、準確、簡便和自動化。目前，許多生物制品公司利用傳統的微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計出各種類型的微生物檢測儀器和設備，逐漸廣泛應用于醫學微生物檢測和科學研究中。例如:

　　4.1試劑盒、培養基和其他手段

　　抗干擾培養基與快速微生物數量檢測技術的結合，解決了傳統微生物檢測方法無法解決的問題，為建立完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。如:抗干擾微生物培養基、新型生化鑒定管、微生物計數卡、環境質量檢測試劑盒等。，可方便地用于多種測試。

　　4.2借助新儀器

　　BACTOMETER的全自動細菌總數和快速細菌檢測系統可在數小時內獲得監測結果，樣本的顏色和光學特性不影響讀數。它對酵母和霉菌的檢測也非常敏感。原理是通過阻抗技術將待測樣品和培養基置于反應試劑盒中，底部有一對不銹鋼電極，測量微生物生長引起的阻抗變化。例如，當微生物生長時，培養基中的大量營養物質可以通過代謝轉化為活性小分子，這種微弱的變化可以用電阻抗法檢測，這樣就可以比傳統的平板法更快地監測微生物的存在和數量。測定項目包括細菌總數、酵母菌、大腸桿菌、霉菌、乳酸菌、嗜熱菌、 革蘭氏陰性菌等。

　　微生物OD值是反映細菌生長狀態的指標，OD是光密度的縮寫，表示被檢測對象吸收的光密度。通常400~700 nm是微生物測定的范圍，所以需要用紫外分光光度計測量吸收波長。最常用的有:菌絲體505 nm，酵母560 nm，細菌600 nm。通過測定OD值繪制微生物生長曲線時，同一菌株的初始培養濃度可準備多個試管(根據檢測點的需要，如需檢測10個點，可準備10個試管)，然后從每個點取一個試管測OD值。

　　一般用于測量細胞密度的OD的波長范圍為580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌的600 nm，已經屬于可見光區(200 nm-400 nm為紫外光區，400 nm-800 nm為可見光區)。如果空白是水做的，需要離心清洗；如果空白是用未接種的培養基制作的，則不需要清洗，但未接種的培養基應與接種同時培養，以達到相同的條件。之后注意OD值一般控制在0.1~0.4，這個區域的數值比較可靠。如果OD大于1.0，則應稀釋并再次測量。因為OD太大，分光光度計的靈敏度會明顯降低。

　　一般測量吸收值，整個實驗過程中保持細菌稀釋倍數一致就好，吸收值與稀釋倍數不成正比，可以保證整個實驗點的可比性。而且取值的時候要連續讀，重復三遍。

　　另外，為什么用分光光度計測量微生物的OD值時，波長要設置為600 nm？

　　這個波長其實只針對濁度，分光光度計在600 nm處對濁度比較敏感。測量吸收峰實際意義不大。例如，在LB搖瓶中過夜培養的大腸桿菌實際上在400納米以上有吸收，但那很可能是培養液的吸收峰。