微生物限度檢查法(薄膜過濾法)
驗證方案
微生物限度檢查法(薄膜過濾法)驗證方案
代碼:表
一、核查方案的起草和批準
1.驗證方案草案
起草人:起草期:年月日
2.驗證團隊成員:
3.驗證方案審計
4.驗證方案批準
批準人:批準日期:
二、驗證方案
1.驗證的目的和原則
1.1驗證目的
為了確認所采用的方法適用于該藥品中細菌、霉菌和酵母菌的測定，特制定本方案。驗證過程應嚴格按照本方案規定的內容進行，因特殊原因確需變更的，應報驗證委員會批準。
1.2原則
通過比較四組試驗菌的恢復生長結果，評價整個試驗方法的準確性、有效性和重現性。
2.驗證方法步驟
2.1驗證前的準備:微生物限度檢查法(薄膜過濾法)驗證前，應對所有平板和稀釋劑進行嚴格檢查。
按照相關滅菌程序進行消毒，確保不影響檢測結果。測試細菌應包括G-、G+、酵母和霉菌微生物，以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。
2.2驗證試驗操作方案:用不同批次產品的三種微生物限度檢查方法進行平行試驗，通過計算回收率判斷限度檢查方法是否對產品有影響。
2.3試驗結果的可接受標準:應使用標準菌株評價方法的微生物限度檢查樣品中微生物的抑制情況。試驗結果應表明，稀釋液對照組的細菌回收率不得低于70%，試驗組的回收率不得低于70%。
3.測試實現
3.1試驗前的準備
3.1.1主要儀器設備:生化培養箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺。
3.1.2操作環境:手術室應安裝空氣除菌過濾層裝置。環境潔凈度不低于10000，局部潔凈度100(或把凈化工作臺放在同一水平)。操作室或凈化工作臺的潔凈空氣應保持對環境的正壓，不低于4.9pa
3.1.3試樣:
批號:批號:批號:
3.1.4培養基:
3.1.5稀釋劑:PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
上述材料經115℃高壓蒸汽滅菌30分鐘。
3.1.6用于驗證的微生物的名稱和編號。
實驗菌株來源:
序列號由細菌名稱、傳代次數和制備日期的首字母組成。
3.1.7儀器:無菌濾膜:(孔徑0.45um直徑50mm)，無菌移液管(5ml)。
4.驗證方法
4.1菌液的制備
大腸桿菌、枯草芽孢桿菌接種于10ml無菌營養肉湯中，于30～35℃培養18～24h。將白色念珠菌接種于改良馬丁液體培養基中，于23 ~ 28℃培養24 ~ 48。將黑曲霉接種于改良馬丁液體培養基中，于23 ~ 28℃培養5 ~ 7天。用0.9%無菌氯化鈉溶液將上述培養物制成每毫升含50 ~ 100個fu菌落的菌懸液。
4.2實驗方法
試液的制備:取10g(ml)樣品，加入100ml ph 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，搖勻使其分散均勻□,用均質機混勻□,置于45℃水浴中使外殼熔化并混勻□,制成1: 10的均勻試液。
樣本測試組
取10ml 1:10試液(相當于1g或1ml試液)，加入100ml稀釋液中，混勻，過濾，用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，在*后的沖洗液中加入50~100cfu菌液，過濾后，取出帶菌濾膜，菌面朝上(與細菌和樣品接觸的面)貼在固化的培養基上。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌附著在營養瓊脂培養基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附著在玫瑰鈉瓊脂培養基平板上。
b菌液群
將上述菌液各1ml加入100ml稀釋液中，混勻，過濾，用稀釋液沖洗濾膜三次，每次100ml。過濾后，取出帶有細菌的濾膜，細菌面朝上(接觸細菌和樣品的一面)貼在固化的培養基上。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌附著在營養瓊脂培養基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附著在玫瑰鈉瓊脂培養基平板上。
c測試樣品對照組
取上述1: 10試液10ml，加入100ml稀釋液中，混勻，過濾，用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，過濾后取出濾膜，貼在已凝固的培養基上，接觸樣品的面朝上。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌附著在營養瓊脂培養基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附著在玫瑰鈉瓊脂培養基平板上。
d稀釋劑對照組
用PH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜三次，每次100ml，最后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，過濾后取出帶菌濾膜，將菌面貼在固化的培養基上。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌附著在營養瓊脂培養基平板上；白色念珠菌和黑曲霉附著在玫瑰鈉瓊脂培養基平板上。
4.3文化
大腸桿菌、枯草芽孢桿菌在30 ~ 35℃培養48h，白色念珠菌和黑曲霉在23 ~ 28℃培養72h，計數菌落數。
5.試驗結果
5.1產品試驗組微生物生長檢查:批號:
5.2對照組微生物生長檢查:批號:
5.3稀釋液對照組微生物生長檢查:批號:
5.4菌液組微生物生長檢查:批號:
6.回收率的計算
6.1稀釋液對照組細菌回收率
表中:回收率=稀釋液對照組平均菌落數÷菌液組平均菌落數×100%。
6.2試驗組細菌回收率
表中:菌液組回收率=(試驗組平均菌落數-試驗對照組平均菌落數)×100%。
7.結論:
7.1經驗證，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率分別為%、%、%、%和%。
7.2稀釋劑的回收率為%、%、%、%。
上述驗證結果證明本品采用上述方法進行微生物限度檢查。